¿Qué es un microscopio de fluorescencia?

Un microscopio de fluorescencia es un microscopio óptico convencional al que se le adapta un accesorio complementario de iluminación, denominado «fluorescencia». En Bioindicación te hablaremos de este accesorio que utiliza los mismos objetivos de aumento para formar la imagen. Al incorporarlo podremos realizar una observación óptica convencional y además una observación de contraste con fluorescencia.

Consideraciones para la adaptación de la fluorescencia

El accesorio de fluorescencia se puede incorporar en el momento de adquirir el equipo o con posterioridad. Este es un aspecto importante a considerar al comprar un microscopio. Porque el fabricante puede cambiar con más o menos asiduidad el catálogo de modelos.

Entonces, puede que cuando queramos adaptar en el futuro el sistema de fluorescencia no sea posible. Por ser un equipo obsoleto, o bien porque el modelo adquirido no disponga de la posibilidad de adaptación.

Deberá tener en cuenta otras consideraciones necesarias a la hora de adaptar un sistema de fluorescencia a su microscopio. Tales como el tipo de óptica (objetivos previstos), tipo de diseño óptico (corrección a infinito, longitud finita, etc.). Consúltenos para informarle según su caso.

Introducción a la fluorescencia: un poco de historia

La fluorescencia es un miembro de la gran familia de procesos de luminiscencia. En el que las moléculas susceptibles emiten luz a partir de estados excitados. Que son creados electrónicamente por un mecanismo físico (por ejemplo, absorción de luz), mecánico (fricción) o químico.

La generación de luminiscencia a través de la excitación de una molécula por fotones de luz ultravioleta o visible es un fenómeno denominado fotoluminiscencia. Este se divide formalmente en dos categorías, fluorescencia y fosforescencia. Dependiendo de la configuración electrónica del estado excitado y la vía de emisión.

La fluorescencia es la propiedad de algunos átomos y moléculas para absorber la luz a una longitud de onda particular. Y, posteriormente, emitir luz de onda más larga después de un breve intervalo, denominada vida útil de fluorescencia.

El proceso de fosforescencia se produce de manera similar a la fluorescencia, pero con un tiempo de vida excitado mucho más prolongado. BIO-MicroscopioFluorescencia-Fig1

Proceso de fluorescencia

El proceso de fluorescencia se rige por tres eventos importantes. Todos ocurren en escalas de tiempo que están separadas por varios órdenes de magnitud (ver Figura 1-a). La excitación de una molécula susceptible por un fotón entrante ocurre en femtosegundos (1015 seg). Mientras que la relajación vibratoria de los electrones en estado excitado al nivel de energía más bajo es mucho más lenta; y se puede medir en picosegundos (1012 seg).

El proceso final es la emisión de un fotón de longitud de onda más larga y el retorno de la molécula al estado fundamental. Este ocurre en el período de tiempo relativamente largo de nanosegundos (109 seg). Toda la vida útil de la fluorescencia molecular, desde la excitación hasta la emisión, se mide en solo mil millonésimas de segundo. El fenómeno es una manifestación sorprendente de la interacción entre la luz y la materia.

Esta interacción conforma la base de los campos expansivos del estado estacionario y de la espectroscopía y microscopía de fluorescencia de resolución temporal. Debido a los perfiles de emisión tan sensibles, la resolución espacial y la alta especificidad de las investigaciones de fluorescencia, la técnica se ha convertido en una herramienta importante (Figura 1-b) en genética y biología celular.

Acuñaron el término

Varios investigadores informaron sobre fenómenos de luminiscencia durante los siglos XVII y XVIII. Pero fue el científico británico Sir George G. Stokes quien describió por primera vez la fluorescencia en 1852. Él acuñó el término en honor a la fluorita mineral fluorescente azul-blanco.

Stokes también descubrió el cambio de longitud de onda a valores más largos en los espectros de emisión que llevan su nombre (conocido como Ley de Stokes. A la que nos referimos más abajo (Figura 1-c y Figura 2). BIO-MicroscopioFluorescencia-Fig2

¿Qué es un microscopio de fluorescencia?

Primeros microscopios de fluorescencia

Los primeros microscopios de fluorescencia fueron desarrollados entre 1911 y 1913. Por los físicos alemanes Otto Heimstaedt y Heinrich Lehmann como un «sucedáneo» del microscopio ultravioleta. Estos se emplearon para observar la autofluorescencia en bacterias, tejidos animales y vegetales.

Poco después, Stanislav Von Provazek impulsó una nueva era cuando usó la microscopía de fluorescencia para estudiar la unión del tinte en tejidos fijos y células vivas. Sin embargo, no fue hasta principios de la década de 1940 que Albert Coons desarrolló una técnica para etiquetar anticuerpos con colorantes fluorescentes. Esto dio lugar al campo de la inmunofluorescencia.

A comienzos del siglo XXI, el campo de la microscopía de fluorescencia provocó una revolución en la biología celular. Este unió al poder de las imágenes de células vivas, el marcado múltiple altamente específico de orgánulos individuales y complejos macromoleculares. Lo hicieron utilizando sondas fluorescentes sintéticas y genéticamente codificadas.

Otros modos

Hay otros modos de microscopía óptica que se basan en características de muestras macroscópicas. Tales como gradientes de fase, absorción de luz y birrefringencia. A diferencia de estos la microscopía de fluorescencia es capaz de obtener imágenes de la distribución de una sola especie molecular. Esto basada únicamente en las propiedades de emisión de fluorescencia. Por lo tanto, utilizándola se puede controlar la ubicación precisa de los componentes intracelulares marcados con fluoróforos específicos. Así como sus coeficientes de difusión asociados, características de transporte e interacción con otras biomoléculas.

Además, la intensa y evidente respuesta en la fluorescencia a las variables ambientales localizadas permite investigar el pH, la viscosidad, el índice de refracción. Así como las concentraciones iónicas, el potencial de membrana y la polaridad del disolvente en células y tejidos vivos.

Microscopio de epifluorescencia

La fluorescencia acoplada a un microscopio tradicional se le denomina epifluorescencia. Porque se inserta por encima del sistema óptico (objetivos de aumento), trabajando por reflexión lumínica como veremos a continuación.BIO-Microsc-Fluoresc-Espectro electromagnético El microscopio óptico debe tener alguna característica especial para que sea un perfecto aliado en nuestro trabajo de bioindicación con fluorescencia. Hablaremos de objetivos que tengan una buena transmisión lumínica.

Los fabricantes diseñan objetivos con lentes de “fluorita” con mayor transmisión lumínica para estos efectos. Aunque son sensiblemente más caros que los convencionales. Y con una buena definición (Apertura Numérica). Pero esto último no es imprescindible para configurarse como un microscopio de fluorescencia para rutina diagnóstica.

Así pues, el accesorio de fluorescencia es un sistema de iluminación complementario. Con un funcionamiento similar al del microscopio óptico convencional. Pero con unas particularidades que lo hacen diferente.

Componentes del microscopio de epifluorescencia

La epifluorescencia consta de:

  • Una fuente de alimentación eléctrica.
  • Un portalámparas que incluye una lámpara de vapor de mercurio. Que es mejor que una lámpara halógena o de tipo led.
  • Un sistema colector de luz y unos filtros de fluorescencia específicos.

BIO-Microsc-Fluoresc-transmicro-detalle2 La fuente de alimentación incluye un transformador independiente que alimenta la lámpara. También un contador horario para controlar las horas de funcionamiento de la lámpara. Ya que éstas tienen una vida corta y sus particularidades de emisión disminuyen con el paso del tiempo. Por eso los fabricantes recomiendan hacer la substitución de la lámpara cada 200-300 horas de trabajo, según modelo y fabricante.

El portalámparas, que alberga la lámpara de vapor de mercurio, debe estar bien ventilado (estas lámparas desprenden mucho calor), con protección térmica de seguridad para evitar quemaduras por descuidos. Y tiene que incluir un sistema de centrado de la lámpara en los tres ejes. Al iluminar una zona muy pequeña (microscópica) deberemos poder concentrar bien la luz emitida sobre nuestra muestra.

Esto lo conseguiremos centrando la lámpara con el eje óptico (eje Y) y con la muestra enfocada (eje X). El tercer eje “Z” nos permite desplazar ligeramente la lámpara hacia un lado, evitando que el reflejo de luz del espejo de reflexión que existe en el portalámparas coincida con la propia lámpara, evitando el sobrecalentamiento de la misma. BIO-Microsc-Fluoresc-esquem

La lámpara de vapor de mercurio, de alta presión, genera un arco eléctrico incandescente en los polos positivo/negativo dónde se concentran las moléculas gaseosas de mercurio. Emite una luz blanca muy intensa que concentraremos sobre la muestra.

La luz generada se canaliza por el sistema colector de luz. Esto permite centrar y seleccionar el haz de luz hasta los filtros.

La ley de Stokes y los filtros de fluorescencia

El sistema de iluminación convencional del microscopio nos permite ver la muestra por transmisión. Esto porque la luz atraviesa la muestra, se recoge en el objetivo formando la imagen y se aumenta en el ocular para enfocarla y hacerla visible.

Por su parte, en el microscopio de fluorescencia la muestra la vemos por reflexión de la luz. En este caso la luz se transmite desde la lámpara de vapor de mercurio mediante el sistema colector de luz hasta el objetivo de aumento. Este ayuda a su vez a concentrar la luz sobre la muestra y ésta se refleja de nuevo con una longitud de onda mayor, pero de menor energía.

Es la ley de física óptica de Stokes. Cuando iluminamos un objeto con luz blanca el color con el que lo vemos corresponde al que más refleja. Por ejemplo, un objeto verde absorbe todas las longitudes de onda y refleja la verde. Uno negro absorbe todas las longitudes de onda y uno blanco las refleja todas.

Los fluorocromos o fluoróforos

En diagnóstico FISH (Fluorescence In Situ Hibridation) se utilizan moléculas que incorporan un determinado fluoróforo o fluorocromo (“colorante”). Con el fin de que cuando se ilumina con una fuente de luz podamos verlo con un color determinado. A nivel molecular la cantidad de luz percibida es muy pobre y si iluminamos con luz blanca una molécula de color no podremos distinguirla. Para ello se utilizan filtros específicos para seleccionar e iluminar solo la muestra con una zona determinada del espectro visible. Estos son filtros de excitación.

BIO-Microsc-Fluoresc-fig6_22
Por ejemplo, un fluorocromo ampliamente utilizado en la técnica FISH es la fluoresceína (FITC). Esta molécula al ser excitada por una luz de longitud de onda de aproximadamente de 495 nm (azul) emite una luz en color verde visible. Esta tiene una longitud de onda mayor (de alrededor de 519 nm), pero de menor energía.

Para ver este fluorocromo en un microscopio de fluorescencia, utilizaremos filtros que acoten la longitud de onda azul de iluminación o filtros de excitación. Y también filtros de barrera (emisión) que permitirán ver la fluoresceína en color verde y no el resto de colores. Así se consiguen acotar las longitudes de onda necesarias de forma que no se interfiera la observación.

Entre medio de estos dos filtros se intercala el espejo dicroico. Este refleja ciertas longitudes de onda y deja pasar (actúa como si fuera trasparente) longitudes de onda mayores. Es básico para seleccionar ópticamente un intervalo correcto de longitudes de onda.

Montaje de los filtros

El fabricante monta estas tres piezas (filtros de excitación, filtros de barrera y espejo dicroico) en forma de cubo. Desplazable respecto al eje óptico para poderlo intercalar en el paso óptico en el momento de la observación, según queramos hacer una observación microscópica convencional o bien una observación con fluorescencia. Cuanto más selectivos sean estos filtros mejor contraste de imagen tendremos en el microscopio. El fondo será más oscuro y la fluorescencia más brillante y contrastada.

BIO-Microsc-Fluoresc-resultados

Nuestro sistema de detección y cuantificación genética microbiana VIT® de Vermicon, se basa en la técnica de contraste FISH. Y requiere de un microscopio de fluorescencia para realizar la lectura y la cuantificación del test.

En MicroPlanet Bioindicación también podemos asesorarle en el uso y suministro de microscopios rutinarios para el análisis de bioindicación convencional. En el de microscopios de fluorescencia debidamente equipados para la analítica VIT® (también como equipo de rutina en EDAR). O en equipos para departamentos de I+D donde se requieren características diferentes a las de rutina.

Puede ampliar la información sobre qué es un microscopio de fluorescencia:

Campus Zeiss
Nikon microscope education
Olympus Microscope Resource Center

MicroPlanet: Hacemos brillar las bacterias

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