Microorganismos viables pero no cultivables en los análisis de aguas

En el análisis rutinario microbiológico de aguas utilizamos procedimientos regulados por normativa que definen exactamente qué tipo de indicadores microbiológicos debemos cuantificar/identificar para comprobar la calidad de nuestra muestra. Con este nuevo post MicroPlanet quiere dedicar un pequeño tiempo y espacio de análisis al riesgo de los microorganismos viables pero no cultivables en los análisis de aguas.

La importancia de realizar análisis exhaustivos que detecten nuevos riesgos

Desde un punto de vista analítico debemos entender que estos análisis rutinarios estandarizados nos muestran datos sesgados. Evidencian sólo una parte de la flora total de la muestra analizada: precisamente aquella que es potencialmente patógena o indicadora de una "deficiente" calidad del agua para la salud humana.

Esta evidencia es cada día más notable gracias los estudios metagenómicos. Aparecen nuevos géneros y especies desconocidos hasta la fecha en muestras donde los análisis rutinarios nos ofrecen resultados aceptables.

Un claro ejemplo son los microorganismos precursores de biofilms. Cuando se encuentran en su ecosistema preferido (por ejemplo agua circulante) se fijan en su etapa bentónica a una determinada superficie (plástica, metálica, cerámica,…), generando inicialmente lo que luego devendrá una estructura más compleja o biofilm autoprotegido. Este biofilm será un reservorio microbiano (potencialmente incluso de bacterias patógenas).

El riesgo potencial es que estas bacterias precursoras, en la mayoría de casos, no son cultivables con los agares tradicionales. Por esta razón no podemos detectarlas en la analítica habitual. Y, si bien no son potencialmente peligrosas para la salud humana, las convierte en microorganismos precursores o indicadores potencialmente peligrosos.

Así, debemos ser conscientes de la importancia del riesgo de todo aquello que nos perdemos en los análisis rutinarios microbiológicos. En este post analizaremos las denominadas células viables pero no cultivables, CVNC (VBNC, Viable But Not Culturables).

Microrganismos viables pero no cultivables en tus muestras de agua

La importancia en el análisis microbiológico para control de aguas de las células viables pero no cultivables (CVNC) es cada vez más evidente. Al margen de lo mencionado anteriormente respecto a géneros y especies viables pero no detectables, investigaciones recientes han demostrado que varios patógenos pueden entrar en un estado CVNC cuando se exponen a una combinación de agentes desinfectantes y sales inorgánicas. Este efecto es muy importante al no ser detectables por los métodos basados en cultivos tradicionales.

En consecuencia, se está produciendo una tendencia en la industria a implementar otras alternativas de detección que nos aporten más información. Como qPCR (quantitative Polymerase Chain Reaction, una variante de la reacción en cadena de la polimerasa utilizada para amplificar y cuantificar en términos absolutos el producto de la amplificación, el ADN), la metagenómica (información genética contenida en todos los microorganismos de una comunidad o muestra ambiental), la secuenciación (identificación genética que se encuentra en uan determinada zona del ADN), etc. Y mantener los análisis rutinarios de cultivo únicamente como el requisito legal e imprescindible para la salubridad de la muestra analizada. Estos análisis genéticos nos permiten determinar con claridad la identidad de los microorganismos presentes en la muestra.

Con el lanzamiento por parte de nuestro socio LuminUltra de la línea de productos GeneCount basada en ADN, se está recopilando mucha información sobre este tema en diversos ámbitos (aguas potables, aguas residuales, gasoil, pinturas,….). En ellos se va descubriendo progresivamente nuevos géneros y especies adaptados a diversos entornos.

Ya hago los recuentos en placa... pero ¿qué me falta?

Durante más de un siglo, los técnicos de laboratorio que trabajan con instalaciones de agua (captura, distribución, tratamiento, mantenimiento) han recurrido a los recuentos en placas de cultivo como herramienta principal para cuantificar el recuento de bacterias en un sistema. Todos conocemos medios como "Plate Count Agar" (Agar de recuento de aerobios mesófilos), el VRBG (Agar Bilis-Rojo Neutro con Cristal Violeta y Glucosa) para recuento de enterobacterias o los medios Cetrimide para Pseudomonas, etc. 

No obstante, puede haber una alteración en nuestras instalaciones. Incluso después de que hayamos aplicado un determinado tratamiento (UV, cloración, etc.), y que los recuentos en placa hayan sido correctos, el agua saliente del sistema puede no estar libre de patógenos.

Realmente, ¿qué está pasando?. En las últimas décadas, se han realizado diversas investigaciones sobre células bacterianas que entran en un estado funcional pero no cultivable bajo ciertas condiciones ambientales (Chen et al., 2017). Estas células, conocidas como células viables pero no cultivables (CVNC), no se detectan con los métodos de recuento en placa habituales, lo que subestima el análisis de patógenos implementado.

¿Cómo pueden formarse?

Cuando las células entran en un estado CVNC, todavía son funcionalmente viables. No obstante han perdido la capacidad de multiplicarse y formar cultivos o, en términos más simples, de multiplicarse. El recuento en placa manifiesta la presencia de colonias detectables visualmente. Estas colonias se forman a partir de una célula original que se ha multiplicado (unidad formadora de colonia) en un medio de cultivo apropiado para ello. Algunas de las causas principales de un estado CVNC pueden ser debidas a cambios ambientales simples, como la temperatura, la presión y el pH.

Por otra parte, también se ha observado que algunos métodos de desinfección comúnmente utilizados para erradicar patógenos, también pueden inducir estados de CVNC en bacterias (Chen et al., 2017). En un experimento realizado por el Dr. Zhang y sus colegas describen un caso en el que la desinfección a través de la dosificación UV dio lugar a una inducción de bacterias CVNC (Zhang et al., 2015). Además, otros experimentos han observado que los tratamientos comunes como la cloración y la cloraminación han provocado esta inducción en ciertas células (Chen et al., 2017).

Pero si no se reproducen, ¿por qué deberían importarme?

Aunque en este estado se convierten en no cultivables, las células CVNC aún mantienen la funcionalidad de una célula cultivable. Esto puede incluir integridad celular, respiración, expresión génica, propiedades de adhesión y potencial de virulencia (Li et al., 2014).

En otro experimento realizado por el Dr. Chen et al. (2017), se evaluaron las características viables de E. coli en su estado CVNC después de los tratamientos de cloración y cloraminación en un cultivo puro. La cloración y la cloraminación son tratamientos biocidas oxidantes. Funcionan atacando la membrana celular, causando daño intracelular y la muerte inevitable de la célula.

Sin embargo, después de estos tratamientos, las membranas celulares de las células CVNC permanecieron intactas. Y la actividad respiratoria y la expresión génica persistieron. De manera alarmante, las células inducidas también fueron capaces de expresar genes para la resistencia a los desinfectantes con el consecuente riesgo sanitario.

Aún así, uno podría preguntarse qué peligro hay en que existan algunas células no cultivables en mi sistema de agua. Dejando de lado a aquellos que piensan que "yo cumplo con lo que me pide la normativa y eso basta", el tema es como mínimo preocupante y a tener muy en cuenta. Obviamente, el problema es que estas CVNC al reubicarse en entornos apropiados, pueden dejar su letargo, reactivarse y volver a ser cultivables.

Realizando cultivos de estas células en medios de crecimiento suplementados con nutrientes y sin nutrientes a 37°C después de una desinfección con cloro, los recuentos en el experimento alcanzaron valores significativos de UFC/mL a las 21 horas y 48 horas de incubación respectivamente (Chen et al., 2017). Este patrón de reanimación puede verse en la Figura 1 para las placas ricas en nutrientes: 

Figura 1: Recuperación de la reanimación de células de E. coli en un entorno rico en nutrientes (Chen et al., 2017)

En consecuencia, dado el tiempo transcurrido entre las analíticas y la ingesta del agua por el consumidor, las bacterias CVNC presentan un riesgo potencial para la salud al estar presentes en los sistemas de agua potable.

¿Qué puedo hacer sino las puedo cultivar?           

Investigaciones anteriores han utilizado la citometría de flujo con determinados fluoróforos para determinar el número de células viables. Estos valores pueden utilizarse luego en combinación con métodos basados ​​en cultivos para cuantificar las células CVNC (Chen et al., 2017). Las técnicas mencionadas anteriormente como qPCR pueden presentar dudas con respecto a si los valores obtenidos corresponden a células viables o no viables (análisis de ADN). En cualquier caso, estos métodos requieren equipos técnicos dedicados, formación específica y capacitación del personal del laboratorio. Y en caso de externalización, tardan días en recibirse los resultados. Durante este tiempo, la concentración bacteriana ya puede haber aumentado exponencialmente en el sistema.

Como alternativa, los kits de análisis de ATP de 2ª generación de LuminUltra nos ofrecen un nuevo parámetro analítico: la biomasa total o población microbiana presente en nuestra muestra, cultivable o no, en cualquier medio acuoso. Con este método rápido las industrias, empresas de servicios y entidades públicas pueden evaluar de manera inmediata la población microbiana total, cultivable o no, en cualquier medio acuoso.

Los análisis con ATP2G^® nos facilitan la cuantificación precisa de la biomasa en pocos minutos. Y nos proporcionan una valoración del nivel de riesgo biológico de nuestro sistema actual. Con este nuevo parámetro podemos tomar medidas correctivas inmediatas, como determinar si se necesita realizar una mayor desinfección o desincrustación específica en nuestro sistema. O bien medidas preventivas, como modificar el tratamiento empleado o incluso verificar la eficiencia y eficacia del tratamiento actual.

Puede encontrar más información sobre las ventajas de los análisis de ATP de 2ª generación, respecto a los métodos tradicionales basados ​​en cultivos, aquí.

Esperamos que este post sobre la importancia de los microorganismos viables pero no cultivables en los análisis de aguas le haya resultado útil. Póngase en contacto con nosotros para cualquier consulta sobre la tecnología ATP2G^® de LuminUltra. Le explicaremos cómo pueden ayudarle los kits rápidos de análisis de aguas y cómo puede implementarlos en su rutina microbiológica. Estaremos encantados de ayudarle.

Artículo basado en el post de Alex Boyd, publicado en la sección Technology-Fundamentals de LuminUltra, sobre la importancia de la cuantificación de las células CVNC.

Referencias:

• Chen, S. et al. (2017). Induction of E. coli into a CVNC state through chlorination/chloramination and differences in characteristics of the bacterium between states. Xiamen: Water Research.
• Li, L. et al. (2014). The importance of the viable but non-culturable state in human bacterial pathogens. Ste-Anne-de-Bellevue: frontiers in Microbiology.
• Zhang, S. et al. (2015). UV Disinfection Induces a CVNC State in Escherichia Psuedomonas aeruginosa. Xiamen : American Chemical Society.

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