¿Cómo funciona la tecnología ATP2G®?

¿Cómo funciona la tecnología ATP2G®?



Conocedores de la importancia de la tecnología de analísis ATP2G® en el control microbiológico de aguas, MicroPlanet les presenta un nuevo post complementario al publicado recientemente. Esta vez profundizaremos en cómo funciona la tecnología ATP2G®, las diferencias respecto a los test de primera generación, y en los retos que se le presentan a la tecnología ATP2G® en el análisis de aguas.

 

El principio de bioluminiscencia: la luz como indicadora de vida

Como ya sabemos, el ATP es el principal portador de energía para todas las formas de vida y solo puede encontrarse en y alrededor de las células vivas. Así, la medición de la concentración de ATP en una determinada muestra proporciona una medición directa de la biomasa o concentración biológica y la salud de la misma.

La tecnología de detección del ATP se basa en el principio de luminiscencia. Mediante una reacción enzimática y en presencia de la proteína Luciferina y la enzima Luciferasa, el ATP se metaboliza desprendiendo luz. Los resultados medidos en un equipo fotodetector (luminómetro) se expresan en URL (Unidades Relativas de Luz).

Esta cantidad de luz resultante es directamente proporcional a la cantidad de ATP presente en la muestra. La siguiente fórmula muestra la reacción de metabolización del ATP en presencia de la enzima luciferasa:

 

En cualquier muestra que contenga microorganismos, el ATP analizado puede presentarse en dos formas particulares de ATP molecular:

  1. ATP intracelular (cATP): contenido dentro de las células biológicas vivas.
  2. ATP extracelular (dATP): ubicado fuera de las células y que ha sido liberado por organismos estresados o muertos. Se denomina ATP extracelular o ATP disuelto (dATP).

La diferenciación y cuantificación precisa de estos dos tipos de ATP es indispensable para realizar mediciones basadas en bioluminiscencia. Con esta medición diferencial obtenemos una evaluación real de la salud y de la actividad biológica del agua. Teniendo un conocimiento más real del estado de nuestra muestra podemos controlar mejor los procesos biológicos.

 

¿Qué cuantifican los kits de análisis ATP2G®?

La ATPmetría de segunda generación (ATP2G®), desarrollada por la empresa canadiense LuminUltra y la francesa Aqua-Tools, es una tecnología microbiológica rápida, fiable, fácil de utilizar y de bajo coste. Constituye un sistema de análisis muy versátil con múltiples aplicaciones en el campo del agua, y en general en todas aquellas industrias que utilizan el agua en sus procesos productivos.

Dependiendo del tipo de kit utilizado para una determinada aplicación, podemos cuantificar varios parámetros:

Total ATP - tATP™

El ATP total (tATP) es el valor total del ATP contenido en la muestra. Es decir, la suma de ATP intracelular (cATP) y del extracelular (dATP).

 

El análisis de tATP (junto a la medición dATP) es uno de los dos análisis implicados en los protocolos de análisis de LuminUltra Industrial (QGO-I) y el de Aguas Residuales (QG21-W). En la mayoría de los kits de análisis de ATP existentes en el mercado (ATP1G), el ATP total es la única medida que se obtiene. Sin embargo, en muchas aplicaciones, la corrección de los antecedentes de ATP disuelto es extremadamente importante.

ATP disuelto - dATP™

El ATP disuelto es la medida del ATP extracelular. La tecnología ATP2G® de LuminUltra es superior a los otros en el mercado, ya que mide la cantidad total de ATP extracelular, no solo el dATP libre o soluble. El ATP extracelular se compone de ATP libre, ATP ligado, ATP complejo y ATP fácilmente extraíble.

El análisis del dATP proporciona información relacionada principalmente con la salud relativa de la biomasa. A medida que la biomasa se degenera o muere, libera ATP en el medio externo. Por lo tanto, un dATP más alto es un resultado directo de la mortalidad de biomasa y un claro indicador biológico.

ATP celular - cATP

El ATP celular es la medida solamente del ATP intracelular. En los protocolos de análisis LuminUltra, se calcula el cATP™ como la diferencia de tATP™ y dATP™.

En la línea de kits comerciales de LuminUltra Aqua (QGA) y LuminUltra Organic (QGO-M) que veremos más abajo, el cATP se mide directamente separando físicamente el dATP contenido en la muestra (mediante filtración). El ATP celular proporciona una indicación directa de la concentración de biomasa viva.

Este parámetro es extremadamente importante para el análisis de aguas en general. El objetivo primordial es limitar en lo posible la cantidad de biomasa viva, como valor alterante de la calidad del agua. Y también, en caso contrario, es un valor muy importante en aplicaciones de tratamiento de aguas residuales donde el objetivo es mantener una población estable de biomasa viva capaz de la biodegeneración. 

Índice de estrés de la biomasa - BSI™

El Índice de Estrés de Biomasa es un parámetro único de los protocolos de análisis LuminUltra Industrial (QGO-I) y LuminUltra Aguas Residuales (QG21-W). Gracias a la exactitud y precisión de estos kits, podemos medir los valores de tATP y dATP, proporcionando no solo una medida precisa de la cantidad de biomasa viva (cATP), sino también un valor relativo de la salud de la población

El BSI se calcula a partir de la relación entre tATP y dATP. A mayor contenido de ATP disuelto en la muestra en relación con el ATP total, mayor será el BSI.

Los valores altos de BSI están relacionados con situaciones estresantes. Por ejemplo, la adición de un biocida como el cloro supondrá un impacto en la biomasa y hará que el BSI aumente. Otras situaciones estresantes como la falta de oxígeno, la toxicidad o las deficiencias de nutrientes, también producirán altos valores de BSI.

En general, podemos decir que el BSI es una "indicador de alerta” en el procesos de aguas industriales o aguas residuales, donde un cambio en BSI indica un cambio en la calidad de la biomasa, en un sentido u otro.

  

Diferencias entre ATP2G® y otros análisis

Existen varios tipos de análisis microbiológicos, a parte de los análisis de ATP1G, que se utilizan habitualmente como control de calidad del agua: cultivos microbiológicos, examen microscópico, métodos de biología molecular (PCR), análisis de partículas, respirometría…

Frente a estas tecnologías, el ATP de 2ª generación ofrece una serie de ventajas:

  • Mayor capacidad de extracción de ATP de la muestra (vs. ATP1G).
  • Sin inhibición ante la presencia de biocidas.
  • Sin interferencias en la detección de la biomasa total.
  • Resultados de concentración microbiológica total (pg/mL).
  • Tiempo de respuesta mucho menor, de días a minutos.
  • No requiere una preparación técnica ni habilidad para realizar el análisis.

Limitaciones del ATP de 1ª generación

Desde la década de los 60, los principios de la medición de ATP se han aplicado con mayor o menor éxito a una variedad de aplicaciones muy diversas. Desde el muestreo ambiental hasta el marino, así como las pruebas de limpieza e higiene de superficies. Esta última aplicación ha sido la más exitosa, especialmente en la industria alimentaria. 

A pesar de sus limitaciones, la rapidez del análisis aporta información valiosa sobre el estado de higiene de una superficie. Muchas compañías de fabricación, procesado y distribución de alimentos han adoptado esta tecnología como un análisis para valorar la contaminación o suciedad total de las superficies de trabajo, o incluso de las aguas de  lavado.

Las ventajas de la prueba de ATP frente a los análisis tradicionales de cultivo son evidentes: los resultados se obtienen en minutos (no días) y los resultados son completos (en lugar de la pequeña fracción de microorganismos que crecerá en los medios de cultivo). Los kits son de muy fácil uso y transportables, permitiendo el trabajo de campo. Es decir, se pueden tomar decisiones en línea de producción de forma instantánea. Sin embargo, ninguna de estas ventajas proporcionará ningún valor añadido sustancial, a menos que los resultados obtenidos sean fiables y precisos. Este ha sido el talón de Aquiles de los métodos de análisis de ATP1G.

Todos estos sistemas ATP1G utilizan los principios básicos de medida y, como tal, proporcionan a los usuarios solo una medición indirecta del contenido de ATP. Estas mediciones, expresadas en URL, como valores de medida no son comparables entre sí. Valores obtenidos en diferentes equipos no pueden ser comparados. Por lo tanto, debido al propio diseño, estos kits de ATP de 1ª generación tienen una aplicabilidad limitada.

 

Los desafíos del ATP2G® en el análisis de aguas

Como con cualquier reacción enzimática, el análisis de ATP mediante luciferasa es susceptible a interferencias que pueden ser causadas por varios componentes en una muestra. Así, los análisis de ATP no se han utilizado de forma generalizada y sostenida en agua, aguas residuales y aplicaciones industriales. Además, el ATP en sí mismo es altamente inestable y se degrada fácilmente a ADP (adenosín difosfato) y AMP (monofosfato de adenosina), a menos que esté combinado con otras moléculas o restos celulares. Esto presenta varios retos que han debido solucionarse para lograr una medición precisa de ATP, que incluyen:

  • Asegurar que el método esté diseñado para cumplir con las características únicas de la muestra.

Las pruebas tradicionales de ATP son comunes para cualquier muestra. Pero existe una gran diversidad de matrices, únicas, que exigen una consideración particular y diferente y, por tanto, se necesitan protocolos y kits diferentes para abordar situaciones específicas. El diseño de kits específicos para diferentes aplicaciones consigue un análisis más preciso y fiable, obteniendo valores más representativos.

  • Incorporar la cuantificación de ATP como un valor de análisis.

Los buenos resultados comienzan con un correcto muestreo y un posterior análisis absolutamente fiable. Se requieren métodos cuantitativos para obtener resultados precisos, reproducibles y comparables.

  • Asegurar la extracción completa del ATP intracelular.

Para obtener una lectura real del ATP, resulta fundamental "recuperar" el ATP de todas las células de la muestra. Este proceso de recuperación (extracción del ATP celular) resulta especialmente difícil, dada la dificultad de la lisis celular en agrupaciones celulares como biofilms, flóculos microbianos o agrupaciones de levaduras y mohos. Así, tener un reactivo de extracción débil (ineficaz) puede conducir a una lisis celular insuficiente o incompleta. Y por tanto, a la recuperación parcial del ATP, generando resultados inferiores a los reales (o incluso falsos negativos).

Es decir, para lograr la máxima recuperación de ATP es importante asegurar que el reactivo de extracción utilizado sea lo suficientemente fuerte como para lisar por completo todos los microorganismos presentes en una muestra. Pero a su vez es necesario que no lo sea en exceso como para inhibir la enzima luciferasa. Afrontar este delicado equilibrio es un importante reto de la ATPmetría que LuminUltra ha superado con años de investigación.

  • Estabilizar todo el ATP intracelular liberado y el ATP extracelular antes del análisis para evitar su degradación.

Los enlaces de alta energía en una molécula de ATP la convierten en una molécula bastante inestable. Cuando no está estabilizada, el ATP se hidroliza fácilmente a ADP y fosfato. La mayoría del ATP extracelular se adhiere a moléculas y restos celulares, de forma que no es un substrato óptimo para reaccionar con la enzima luciferasa.

En el momento de la extracción del ATP intracelular sucede esto precisamente. Es un paso crítico en el análisis. Si no se estabiliza, la inestabilidad del ATP extraído puede dar lugar a resultados inferiores a los reales, ya que la mayoría de ATP se habría degradado o combinado antes de metabolizarse con la luciferasa. Es importante pues, asegurar que todo el ATP extracelular combinado y todo el ATP intracelular extraído se estabilicen rápida y eficazmente para una recuperación máxima.

  • Asegurar que los componentes de la muestra no inhiban la enzima luciferasa.

Las muestras de agua a menudo contienen componentes que inhiben o inactivan la reacción enzimática de ATP. Cuando no se trata eficazmente la muestra, estos agentes inhibidores (quenching) disminuyen la producción de luz de la reacción enzimática. Las lecturas del luminómetro son menores de lo que deberían ser y producen resultados equívocos.

La inhibición se pueden originar por varias causas, incluyendo el propio color de la muestra, la presencia de sólidos disueltos, compuestos orgánicos en suspensión, metales pesados, biocidas, etc. Por lo tanto, es importante minimizar o neutralizar los efectos de todos estos componentes que pueden estar presentes en la muestra antes de dosificar la luciferasa.

  • Minimizar las influencias externas en el resultado final del test.

El resultado del análisis de ATP se mide en un luminómetro y se expresa en unidades relatvas de luz (URL). Este resultado puede verse afectado no solo por la cantidad de ATP en la muestra, sino también por condicionantes externos a la reacción. Por ejemplo, la temperatura de reacción, la marca y modelo comercial del luminómetro utilizado (sensibilidad, exactitud, precisión) y el estado del equipo (calibración), y también la edad, la potencia y la concentración de la enzima, entre otras cosas.

LuminUltra tiene en cuenta estas variables convirtiendo las URL en concentraciones de ATP. Para ello, utiliza su patrón estándar de ATP líquido y estable, UltraCheckTM. Usar valores de URL no convertidos como resultados finales es equivalente a usar un instrumento no calibrado.

Superar todos estos desafíos es la clave para un protocolo de análisis de ATP preciso y fiable.

Como hemos ido viendo, la monitorización rutinaria del ATP tiene una serie de ventajas. La más evidente es la rapidez de respuesta: solo cinco minutos desde que se obtiene y procesa una muestra hasta que se obtiene un resultado. Esto permite a los usuarios trabajar casi con resultados a tiempo real y tomar decisiones de forma inmediata, pero debemos tener en cuenta que sólo serán efectivas si los análisis realizados, además, tienen total fiabilidad y exactitud. 

Los kits de análisis QG de LuminUltra están diseñados para hacer el análisis de forma sencilla, en el laboratorio, en planta o en el propio campo, pudiendo ser utilizados por personal no cualificado técnicamente.

 

Resumiendo: las 5 ventajas principales de la tecnología ATP2G™

  • Rápida: proporciona resultados en minutos en lugar de horas, días o semanas.
  • Exacta: los kits de análisis ATP2G™ están diseñados específicamente para muestras de agua, aguas industriales de proceso y de aguas residuales.
  • Completa: logra la recuperación total de todos los microorganismos presentes en la muestra, no solo de una pequeña fracción.
  • Cuantitativa: incluye un patrón de medida (incluido en el kit) para cuantificar y normalizar los resultados.
  • Fiable: los productos LuminUltra cumplen con los más altos estándares de calidad y personal experto que brinda un soporte exhaustivo para todas las aplicaciones.

Si quiere profundizar más, consulte nuestro anterior post Qué es la tecnología ATP2G para el análisis rápido de aguas. Encontrará información sobre el desarrollo  y nacimiento de los análisis de segunda generación de ATP, y sobre la gama de kits de análisis Quench Gone de LuminUltra.

Contacte con nosotros si necesita asesoramiento sobre la aplicación de la tecnología ATP2G® de LuminUltra en sus controles microbiológicos habituales. Le ayudaremos a elegir aquellos productos que mejor cubran sus necesidades.

 

MicroPlanet: Mejorando la calidad y la productividad en su trabajo

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


BUSCAR